想選擇合適的二抗就必須會這些常識！ 二抗是指用于靶向結(jié)合一抗的抗體。在多種免疫印跡、ELISA以及免疫熒光等免疫實(shí)驗(yàn)中，二抗經(jīng)常和一抗結(jié)合使用以檢測目標(biāo)蛋白。很多二抗都帶有標(biāo)記物，例如AlexaFluor熒光染料或辣根過氧化物酶（HRP），從而使二抗的信號可以被檢測到。
實(shí)驗(yàn)中也可以使用帶有標(biāo)記物的一抗，但是二抗有很多優(yōu)點(diǎn)。無論是使用哪種一抗進(jìn)行檢測，使用二抗可便于更換不同的標(biāo)記物。例如，同樣的一抗可以與HRP標(biāo)記二抗一起用于免疫印跡，也可以與另一種AlexaFluor488熒光標(biāo)記二抗一起用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)。
另外，二抗結(jié)合在抗原位置的標(biāo)記染料比直標(biāo)一抗要多，從而增強(qiáng)檢測信號。使用二抗可以避免對一抗進(jìn)行復(fù)雜且昂貴的化學(xué)標(biāo)記（偶聯(lián)），而且偶聯(lián)反應(yīng)（具有氨基酸特異性）可能干擾一抗對抗原的識別。
選擇合適的二抗
要選擇出一種適用于您的應(yīng)用和研究的佳二抗，建議考慮以下因素：
種屬來源和種屬反應(yīng)性；特異性反應(yīng)；純化方法；交叉吸附；多重檢測能力；抗體類型和亞型；完整抗體還是抗體片段；標(biāo)記物；生物素結(jié)合蛋白。
01 種屬來源和種屬反應(yīng)性
種屬（Host）來源是指制備這種二抗的物種。常見種屬來源包括雞、驢、山羊、小鼠、兔、大鼠以及綿羊。因大多數(shù)一抗是在小鼠或兔的體內(nèi)制備的，山羊來源的抗鼠、抗兔IgG二抗是廣泛的商業(yè)化二抗。
注意：所用二抗的種屬來源必須不同于一抗的種屬來源和反應(yīng)種屬。例如，如果一抗來源于兔，則不能使用來源于兔的二抗。
02 特異性反應(yīng)
區(qū)別于一抗的特異性概念（一抗只識別目標(biāo)蛋白），二抗的特異性指針對一抗的反應(yīng)特異性，其不僅包括特異識別目標(biāo)物種（一般經(jīng)交叉吸附），還包括特異識別目標(biāo)免疫球蛋白（Ig）的類型或亞型，以及該二抗是否和抗體的特定部分結(jié)合。
常識：如果一抗使用兔多抗，則需要使用抗兔二抗。如果一抗是鼠IgG2b，則二抗需特異識別該亞型。
03 純化方法
動物血清或腹水一般經(jīng)四種常見純化方法：親和純化、特異性純化、層析法、脫鹽法。大多數(shù)Invitrogen二抗經(jīng)過親和純化（protein A或protein G），純化后抗體純度能達(dá)到95%以上。特異性純化是將抗原固定后進(jìn)行純化的方法，可以保證抗體純度和特異性更高，大多數(shù)Invitrogen流式應(yīng)用的二抗都經(jīng)過此方法純化。
04 交叉吸附（Cross-Adsorbed）
對二抗進(jìn)行交叉吸附可以幫助去除來源于非目標(biāo)抗體和蛋白的交叉反應(yīng)性，從而提高抗體的特異性。交叉吸附是指將親和純化的二抗通過一個(gè)固定有其它種屬來源的抗體或血清蛋白的純化柱。能夠識別這些其它種屬來源的抗體或血清蛋白的二抗將結(jié)合在純化柱上，通過這種方法可以獲得交叉反應(yīng)性更低的二抗，從而降低背景和提升抗體效價(jià)。
